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KY BLOG

昆虫と微生物の研究とアート

定量PCR

久しぶりにリアルタイムPCRをおこなった。リアルタイムPCRとは、PCRによる増幅サイクルの途中に毎回、産物の量を蛍光で読み取ることによって増幅曲線を描き、その増幅曲線の形からもとのDNA量を推定する方法だ。定量PCRともいう。

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茶色の曲線は、濃度のわかっているサンプル(スタンダード)で、左から順に、1マイクロリットルあたりのコピー数が、10の9乗、10の8乗、10の7乗、10の6乗、10の5乗、10の4乗。

赤色の曲線が測定したサンプル。


【スタンダードの作り方】

  • PCR産物をアガロースゲル電気泳動→ゲルから切り出して精製→吸光度測定(DNA濃度の単位は、μg/μL)
  • 1塩基あたりの分子量を309[g/mol]とし、1モルに含まれる分子の総数は6.02X10の23乗個(アボガドロ定数)であることからDNA濃度をコピー数で表すことができる(単位は copies/μL)
  • コピー数表示で濃度がわかったらそれを10の9乗/μL、10の8乗/μL、10の7乗/μL・・・になるように希釈していく。