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KY BLOG

昆虫と微生物の研究とアート

タンパク質分解酵素を使わないDNA抽出

純度の高いDNAが必要ではないときは、よくProteinase Kとよばれるタンパク質分解酵素で細胞や組織を処理し、遠心したあとの上清を用いることが多い。

Looke M, Kristjuhan K, Kristjuhan A (2012) Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. BioTechniques 50: 325-328.

この論文では、タンパク質分解酵素のかわりに酢酸リチウムを使ってDNAをとる方法を紹介している。プロトコールは以下の通り。

  • 100 μl の酢酸リチウム・SDS溶液(200 mM 酢酸リチウム; 1% SDS)の中でサンプルをすり潰す
  • 70℃で5分
  • 100% エタノールを300 μl 加え、ボルテックス
  • 15000 rpm で3分間遠心し、ペレット以外を捨てる
  • 70% エタノールでペレットを洗う
  • 100 μl の水あるいはTEバッファーでペレットを溶かし、15000 rpm で15秒遠心
  • 上清をPCRに用いる

キアゲン社のDNA抽出キット(DNeasy)を使ってもうまくDNAがとれない虫があって困っていたので試してみることにした。

 

f:id:dskkgym:20120822112017j:plain

 (1と2:Proteinase K入りのバッファー内ですりつぶし、温度処理、遠心後、上清を使用/3と4:今回の方法/5:キアゲンのDNeasyによる)

 

DNAがとれたかどうかは、ミトコンドリアDNAがPCRで増えるかどうかで確認した。上の泳動写真からわかるように、見事に酢酸リチウム法だけうまくいっている。

エタノール沈殿自体に効果があったのかも知れないと思い。Proteinase K法とLiOAc法をどちらもエタノール沈殿を含めてやってみた。

 

f:id:dskkgym:20120822112749j:plain

 エタノール沈殿によりProteinase K法は改善されたものの、増えないサンプルは増えない。一方、LiOAc法ではどのサンプルも安定して増えている。

 

このことから、Proteinase KではなくLiOAcを使った方がうまくいくと思っていたのだが、よくよく考えたらSDSの効果かもしれない。LiOAcを使ったときだけSDSを使っていたのだ。

 

後日どちらの方法にもSDSを入れてやり直してみることにする。